Le substitut du glyphosate à la glycine dans les protéines des cellules de mammifères se divisant activement?

Un article récemment publié par Antoniou et al. avec le titre en caractères gras, « Le glyphosate ne remplace pas la glycine dans les protéines des cellules de mammifères en division active ». [1]. Le document impliquait d’exposer les cellules cancéreuses du sein humain au glyphosate pendant six jours, puis d’utiliser une technique sophistiquée appelée marquage Tandem Mass Tag (TMT) pour identifier les peptides courts supposés contenir des molécules de glycine anormalement lourdes. Les protéines des cellules traitées et non traitées ont été soumises à un protocole standard impliquant la spectrométrie de masse, la protéolyse partielle et une analyse plus poussée, comme détaillé dans l’article.

Les cellules ont été maintenues sur une formulation nutritionnelle riche appelée milieu de Eagle modifié de Dulbecco. Cette formulation est une modification du basal medium eagle original, enrichi en acides aminés et en vitamines. Il a également une concentration élevée de glucose à 4500 mg / L. Il n’y a aucune garantie qu’il n’est pas contaminé par le glyphosate. En outre, les cellules avaient été cultivées pendant une période non spécifiée dans le passé et avaient probablement accumulé un nombre important de protéines contaminées au glyphosate mal repliées qui étaient difficiles à éliminer. Ils ont probablement déjà commencé leur vie en culture avec des protéines contaminées par le glyphosate, par le biais d’une exposition à vie au glyphosate de l’homme hébergeant à l’origine ces cellules dans une tumeur mammaire.

Les auteurs ont testé les échantillons à la recherche de deux modifications post-traductionnelles différentes: la cystéine modifiée par le glyoxylate et la substitution du glyphosate à la glycine. Ils ont inclus la modification du glyoxylate car ils ont émis l’hypothèse que le glyphosate pourrait se décomposer en glyoxylate, capable de se lier aux résidus de cystéine. Notamment, ils n’ont détecté aucune cystéine modifiée par le glyoxylate dans les cellules témoins ni dans les cellules traitées.

En revanche, les auteurs ont trouvé un signal important de présence de glyphosate dans plusieurs peptides courts dans les échantillons traités. Cependant, ils ont également trouvé un signal également fort dans les échantillons non traités. Ils ont écrit: « Dans cette expérience, cependant, aucun des deux PTM putatifs (modifications post-traductionnelles) d’intérêt ne devrait être présent en l’absence de traitement au glyphosate. Il était donc possible d’utiliser le marquage TMT pour identifier et filtrer toute fausses découvertes potentielles. »Et ensuite:« Les données montrent de manière concluante que tous les peptides substitués candidats sont de fausses découvertes. « 

Un argument également plausible, cependant, est que les cellules « non traitées » hébergent également des protéines substituées par le glyphosate. Potentiellement, la plupart des peptides substitués candidats, sinon tous, sont de véritables découvertes. Les cellules traitées et les cellules témoins ayant été exposées au glyphosate pendant une longue période dans le passé, il est vraisemblable qu’elles aient toutes les deux accumulé des protéines contaminées par le glyphosate en quantités presque égales. Anthony Samsel et moi avons discuté dans notre premier article sur la substitution du glyphosate à la glycine et ont démontré que les glycines N-substituées peuvent former des peptoïdes très difficiles à décomposer et qu’il a été démontré que les phosphonates possèdent une capacité à inhiber la protéolyse [2].

L’idée selon laquelle l’exposition au glyphosate entraîne l’accumulation de protéines résistantes à la protéolyse est confortée par une étude publiée en 2013 sur des plantes de pois [3]. Les auteurs ont observé une accumulation de protéines ubiquitinées ainsi qu’une régulation positive des enzymes de protéolyse, ce qui est surprenant et inhabituel. Ils ont écrit:

« L’accumulation de protéines ubiquitinées, ainsi que l’augmentation de l’activité putative du protéasome ont été observées grâce au profilage protéique basé sur l’activité (ABPP), indiquant un rôle du protéasome lors du traitement par herbicide. L’accumulation de protéines ubiquitinées a généralement été décrite Nos résultats ont néanmoins montré une augmentation des niveaux et des activités du substrat protéasome, de sorte que le stress induit par l’herbicide sur le protéome pourrait entraîner l’accumulation de protéines ubiquitinées, malgré l’activité accrue du protéasome ou la disponibilité accrue du substrat. induire une activité protéasome « .

Une explication probable est que le glyphosate incorporé dans les protéines perturbe la capacité des enzymes protéolytiques à le dégrader. En fait, dans un article liant le glyphosate à la sclérose latérale amyotrophique (SLA), nous avons décrit comment le glyphosate pourrait perturber le processus d’ubiquitination lui-même, qui marque les protéines à déléter par le protéasome [4]. On a écrit:

« Le plus intriguant est le fait que l’ubiquitine elle-même dépend de manière critique d’une paire de glycine double carboxy-terminale hautement conservée pour construire les chaînes d’ubiquitine complexes signalant la dégradation d’une protéine [46] [reproduite ici sous la forme [5]]. Substitution du glyphosate de ces glycines essentielles devrait entraver le processus de recyclage des protéines mal repliées. Cela pourrait facilement expliquer l’accumulation de protéines mal pliées qui est une caractéristique de la SLA.  »

Heureusement pour nous, Antoniou et al. [1] ont fourni dans leur tableau 3 les séquences exactes avec des substitutions de glyphosate qui ont été détectées, et le site Web d’Uniprot fournit un outil permettant de trouver des protéines contenant des séquences spécifiques, à l’aide d’un logiciel appelé BLAST. Uniprot a pu récupérer l’identité de la totalité des 15 protéines fournies sous forme de hits dans leur Figure 3, avec une correspondance exacte avec une séquence présente dans chaque protéine. Les 15 protéines étaient des protéines humaines. Au moins neuf de ces protéines se lient à des molécules contenant du phosphate, comme indiqué dans le tableau 1. Cela conforte l’idée selon laquelle les protéines qui se lient au phosphate sont particulièrement sensibles à la substitution du glyphosate, comme indiqué dans un article récent publié par Gunatilake et al. [6], proposant que le glyphosate soit un facteur majeur de la néphropathie chronique à étiologie inconnue (CKDu) chez les travailleurs agricoles du Sri Lanka. En fait, la protéine EPSP synthase présente dans les plantes, qui serait la principale cible du glyphosate dans la destruction des mauvaises herbes, contient un résidu de glycine hautement conservé au site de liaison du phosphoénol pyruvate (PEP). Les chercheurs de DowDupont ont pu utiliser la technologie CRISPR pour créer une souche de maïs résistante au glyphosate, grâce à un gène modifié par CRISPR pour EPSP synthase [7]. La première étape consistait à modifier le code de l’ADN afin de remplacer la glycine située sur le site de liaison du PEP par de l’alanine. Cela a abouti à une version de l’enzyme complètement insensible au glyphosate.

Tableau 1: Neuf protéines contenant des peptides substitués au glyphosate, identifiées à l’aide d’outils de spectrométrie Tandem Mass Tag (TMT). Ces peptides, ainsi que 6 autres, ont été trouvés dans des cellules cancéreuses cultivées en culture. Les neuf se lient aux molécules contenant du phosphate comme indiqué dans la troisième colonne. La première colonne fournit la séquence détectée, où le « * » indique un résidu glycine qui s’est avéré être substitué. Voir: Antoniou et al. (2019) pour plus de détails sur la configuration expérimentale.

Séquence Nom de la Protéine Substrat contenant du phosphate
AIRQTSELTLG*K Protéine à doigt de Zinc 624 ADN
DG*QDRPLTKINSVK Famille appartenant au domaine d’homologie de Pleckstrin Un membre 5 Phosphatidylinositol phosphate
EPVASLEQEEQG*K Double protéine homéobox A ADN
G*ELVMQYK Diacylglycérol kinase gamma ATP
GKELSG*LG*SALK Acyl-CoA déshydrogénase spécifique mitochondriale à très longue chaîne FAD
KDGLG*GDK Récepteur couplé à la protéine G 158 GTP
NEKYLG*FGTPSNLGK Protéine Clp dépendante de l’ATP, sous-unité de liaison à l’ATP ATP
RTVCAKSIFELWG*HGQSPEELYSSLK Homologue d’ARNt (guanine (10) -N2) méthyltransférase ARNt
VTG*QLSVINSK Protéine O-mannosyl-transférase 2 (Q9UKY4) phosphate de dolichyle

Globalement, le tableau 1 révèle une liste intrigante de protéines humaines, et nombre d’entre elles devraient être exprimées dans les cellules cancéreuses du sein. Par exemple, l’un est une protéine de méthylation d’ARN (homologue d’ARNt (homologue de la guanine (10) -N2) – méthyltransférase). Une autre possède une fonction de suppression de tumeur par inhibition de l’Akt, en se liant à des phosphatidylinositol phosphates (membre A de la famille du domaine d’homologie de Pleckstrin 5). Un autre est un récepteur couplé à la protéine G (GPCR). Selon Bar-Shavit et al., « Les GPCR contrôlent de nombreuses caractéristiques de la tumorigenèse, y compris les fonctions induites par les cellules immunitaires, la prolifération, l’invasion et la survie sur le site secondaire ». Une autre variété à succès est une protéine homéobox, et on pense que cette classe de protéines joue un rôle causal dans le cancer du sein [9].

Une autre découverte importante de cet article concerne les deux protéines qui ont été identifiées comme étant régulées positivement de manière significative en réponse au traitement au glyphosate sur six jours. Ceux-ci sont: ADP / ATP nucléotide translocase (ANT) et le facteur 6 riche en sérine / arginine (SRSF6) [1]. Ces deux protéines s’avèrent très intéressantes, car on sait qu’elles sont surexprimées dans les cellules tumorales et, dans les deux cas, des taux plus élevés de ces protéines sont liés à un mauvais pronostic chez les patients cancéreux.

SRSF6 fait partie de la famille des facteurs d’épissage qui possèdent de puissantes capacités pour modifier l’expression des protéines, en modifiant la manière dont les peptides sont assemblés à partir d’exons individuels. La surexpression de SRSF6 dans les cellules épithéliales du poumon a augmenté la prolifération, les a protégés de la chimiothérapie et a accru leur capacité à former des tumeurs [10]. En outre, l’inactivation de SRSF6 dans les lignées de cellules cancéreuses du poumon et du côlon a réduit leur potentiel tumorigène. SRSF6 est fréquemment exprimé dans les cancers de la peau et modifie l’épissage d’une protéine appelée ténascine C afin de favoriser les cancers invasifs et métastatiques [11]. SRSF6 provoque également une prolifération excessive de kératinocytes, caractéristique du psoriasis [12]. Si le glyphosate provoque la régulation positive de SRSF6 dans les cellules cancéreuses du sein, il provoque probablement une tumorigenèse accrue chez les humains exposés.

L’ANT se présente sous plusieurs isoformes ayant des effets différents sur la biologie cellulaire, mais celle qui est fortement exprimée dans les cellules cancéreuses du sein est ANT2 et s’est révélée être importante pour le maintien de la survie de la tumeur. ANT2 a pour tâche de transporter l’ATP dans les mitochondries. Cette activité est importante lorsqu’une cellule fonctionne sous l’hypothèse de l’effet Warburg. Les cellules cancéreuses produisent beaucoup d’ATP dans le cytoplasme par glycolyse, puis ANT2 transporte l’ATP dans les mitochondries afin qu’elles puissent réduire la quantité d’ATP dont elles ont besoin pour se produire par phosphorylation oxydative. C’est une bonne stratégie pour se protéger des dommages oxydatifs, en particulier lorsque les mitochondries peuvent être dysfonctionnelles en raison de mutations de l’ADN résultant d’expositions toxiques. ANT2 programme en fait une cellule pour mettre en œuvre des stratégies conduisant à une prolifération accrue plutôt qu’à l’apoptose (mort cellulaire) en présence de facteurs de stress [13]. Il y a eu un intérêt récent à développer des médicaments qui combattent le cancer en supprimant l’activité de ANT2 [14].

Antoniou et al. Le papier pourrait constituer une avancée significative dans notre quête d’une procédure de détection de la contamination des protéines par le glyphosate. Il est remarquable qu’ils aient pu identifier 15 protéines humaines qui semblent avoir été modifiées par substitution du glyphosate à un résidu de glycine spécifique. Le papier présente un grand intérêt pour la communauté dans son ensemble, car il spécifie une procédure prescrite qui peut maintenant être appliquée de manière plutôt routinière à plusieurs autres types de cellules cultivées en culture, ainsi que sur des échantillons biologiques extraits de tissus malades de mammifères, tels que les ongles des patients atteints de sclérodermie, des cellules cutanées chez les patients atteints de psoriasis, des échantillons de poils d’enfants autistes, des sabots de chevaux atteints du fondateur, des biopsies tumorales, une plaque d’Alzheimer post mortem, des tissus rénaux et hépatiques malades, etc.

Les occasions futures de découvrir des protéines contaminées par le glyphosate abondent et, alors que nous collectons une base de données de modèles de substitution spécifiques, nous pourrons peut-être même prévoir des règles pour les contextes peptidiques où les résidus de glycine sont particulièrement sensibles, comme lorsque les acides aminés voisins sont petits encombrement stérique) ou positivement chargé (pour attirer le glyphosate sur le site de l’assemblage peptidique en raison de sa charge négative). En effet, ces types de règles deviennent déjà apparents dans le petit ensemble retrouvé dans l’Antoniou et al. expérience. Six des 15 glycines substituées présumées étaient immédiatement suivies d’un acide aminé chargé positivement (lysine, histidine ou arginine). Et dix ont été immédiatement précédés de l’un des suivants: valine, leucine, sérine ou thréonine, qui sont tous de petits acides aminés, supportant l’espace pour la queue méthylphosphonyle du glyphosate. Si le glyphosate se substitue bien à la glycine lors de la synthèse des protéines, les conséquences en sont ahurissantes et les effets toxiques cumulatifs insidieux du glyphosate peuvent facilement expliquer l’augmentation actuelle de la prévalence d’une longue liste de maladies auto-immunes, métaboliques, neurologiques et oncologiques.

Références

[1] MN Antoniou et al. Glyphosate does not substitute for glycine in proteins of actively dividing mammalian cells. BMC Res Notes 2019; 12:494. (Web Link)
[2] A Samsel and S Seneff. Glyphosate, pathways to modern diseases V: Amino acid analogue of glycine in diverse proteins. Journal of Biological Physics and Chemistry 2016; 16: 9-46. (Web Link) (Download)
[3] A Zulet et al. Proteolytic Pathways Induced by Herbicides That Inhibit Amino Acid Biosynthesis. PLoS ONE 2013; 8(9): e73847. (Web Link)
[4] S Seneff et al. Does glyphosate acting as a glycine analogue contribute to ALS? J Bioinfo Proteomics Rev 2016: 2(3): 1-21. (Web Link) (Download)
[5] A Zuin et al. Ubiquitin signaling: Extreme conservation as a source of diversity. Cells 2014; 3(3): 690-701. (Web Link)
[6] S Gunatilake et al. GlyphosateтАЩs Synergistic Toxicity in Combination with Other Factors as a Cause of Chronic Kidney Disease of Unknown Origin. Int J Environ Res Public Health 2019; 16(15). pii: E2734. (Web Link) (Download)
[7] Y Dong et al. Desensitizing plant EPSP synthase to glyphosate: Optimized global sequence context accommodates a glycine-to-alanine change in the active site. J Biol Chem 2019; 294(2): 716-725. (Web Link)
[8] R Bar-Shavit et al. G Protein-Coupled Receptors in Cancer. Int J Mol Sci 2016; 17(8). pii: E1320. (Web Link)
[9] MT Lewis. Homeobox genes in mammary gland development and neoplasia. Breast Cancer Research 2000; 2: 159. (Web Link)
[10] M Cohen-Eliav et al. The splicing factor SRSF6 is amplified and is an oncoprotein in lung and colon cancers. J Pathol 2013; 229(4): 630-9. (Web Link)
[11] MA Jensen et al. Splicing factor SRSF6 promotes hyperplasia of sensitized skin. Nat Struct Mol Biol 2014; 21(2): 189197. (Web Link)
[12] H Valdimarsson et al. Psoriasis: a disease of abnormal Keratinocyte proliferation induced by T lymphocytes. Immunol Today 1986; 7(9): 256-9. (Web Link)
[13] SH Baik and J Lee. Adenine nucleotide translocase 2: an emerging player in cancer. J Stem Cell Res Med 2016; 1(2): 66-68. (Web Link)
[14] J-Y Jang et al. Suppression of adenine nucleotide translocase-2 by vector-based siRNA in human breast cancer cells induces apoptosis and inhibits tumor growth in vitro and in vivo. Breast Cancer Research 2008; 10(1): R11. (Web Link)


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